Deux ans ont passé et Peter Parker doit faire face à des nouveaux obstacles. Ses sentiments pour M.J. (Kirsten Dunst) sont de plus en plus forts alors qu'il réprime l'envie de tout lui révéler: son identité et son amour. Son amitié avec Harry Osborn (James Franco) est altérée par l'amertume de Harry après la mort de son père. Il mène une véritable vendetta contre Spider-Man. Tout devient incroyablement compliqué alors que Peter rencontre un nouvel ennemi, Dr. Otto Octavius - Octopus (Alfred Molina). Peter doit se servir de tous ses pouvoirs afin d'enrayer les plans de ce fou diabolique.